10X Genomics 3′ 技术
1、技术优势
通量高：一次可以同时测8个样本，每个样本最多可以检测到上万个细胞。
周期短：7分钟内完成上万个细胞封装，一天之内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库。
单细胞率高：单个GEMs捕获到多个细胞的概率极低（＜0.9%/1000cells）。
捕获效率高：细胞捕获效率高达65%。
应用范围广：动物细胞和植物细胞均可以进行单细胞测序，已广泛应用于肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测和胚胎发育研究等。
2、实验操作方法及流程
如图所示，10X Genomics的Chromium系统利用微流控系统将含有Barcode的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs（油包水的微体系）。GEMs形成后，细胞在其中裂解，释放出mRNA，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，利用PloyT引物捕获液滴中的mRNA。随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA，构建标准测序文库。
2.1 单细胞悬液制备
新鲜组织样本需要消化成单细胞悬液，对于培养的细胞或已经处于悬浮状态的细胞，需要对细胞洗涤以去除培养基。在进行单细胞RNA-seq之前，可以使用冷冻保存或甲醇固定来储存细胞。对于进行单细胞测序实验的样本，要求细胞活性>70%， 细胞浓度在700-1200细胞/μl，细胞尺寸最大不超过30μm。
2.2 细胞分选
如上图所示，10X Genomics运用微流控系统进行细胞分选，凝胶珠匀速地从左方（图示）进入，待分选的细胞和酶从下方（图示）以一定时间间隔进入，与凝胶珠一起油相中形成GEMs（Gel Bead in emulsion）。如图所示，凝胶珠上的寡核苷酸链依次为Illumina TruSeq Read 1测序引物、16bp 10X Barcode序列（用于区分细胞）、12 bp unique molecular identifier（UMI，区分细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，降低扩增偏好性）、30 bp poly dT反转录引物。在随后的文库构建中，相同的细胞扩增出的cDNA带有相同的10x Barcode，其中来自相同的转录本的cDNA会带有相同的UMI，由此，便可区分出不同细胞扩增出的cDNA。一般而言，每个GEMs只会包含一个细胞和一个凝胶珠，但有时候也会出现一个GEM里没有或有多个细胞的情况，对于这种GEMs则需要通过在后续分析中识别出来并进行去除。
2.3 cDNA生成与扩增
形成GEMs后，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，凝胶珠中的polyT捕获mRNA中的polyA，并逆转录生成用于测序的cDNA。然后破坏油包水结构，使用磁珠纯化cDNA并进行清洗，再进行扩增反应，纯化后进行质检，质检合格后进行文库构建。
2.4 文库构建
cDNA扩增完成后，利用酶将cDNA打断成片段，通过末端修复、并加入A碱基，连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index、P5、P7接头，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库，文库质检合格后再上机测序。
2.5 文库测序
文库质检合格后，就使用Illumina双端测序平台进行测序。如图所示，Illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis,SBS）。
