CX Genomics 3′ 技术
1、技术优势
高精度：单细胞精度达到90%以上
高通量：每个样本最多可以检测到上万个细胞
周期短：一天之内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库。
应用范围广：动物细胞和植物细胞均可以进行单细胞测序，已广泛应用于细胞异质性、免疫细胞群体检测和胚胎发育研究等。
2、实验操作方法及流程
如图所示，Pure-Cell单细胞测序系统利用微流控系统将含有Barcode、UMI（unique molecular identifier）和Poly（dT）的Bead、细胞和油三者混合，形成上万个纳米级油包水的微体系。油包水结构形成后，细胞在其中裂解，释放出mRNA，Bead利用PloyT引物捕获液滴中的mRNA。随后破坏油包水结构，收获捕获mRNA的Beads，进行逆转录，产生带有Barcode和UMI信息的cDNA，构建标准测序文库。
2.1 单细胞悬液制备
新鲜组织样本需要消化成单细胞悬液，对于培养的细胞或已经处于悬浮状态的细胞，需要对细胞洗涤以去除培养基。单细胞悬液制备完成后需尽快进行上机捕获，也可通过细胞保存液进行短时间内保存。单细胞转录组测序要求样本细胞活率>85%，细胞浓度在700-1200细胞/μl，细胞数量在5×106以上。/p>
2.2 细胞分选
如上图所示，Pure-Cell单细胞测序系统运用微流控+人工智能系统进行细胞分选，悬浮在裂解液的Beads匀速地从左方（图示）进入，待分选的细胞从下方（图示）以一定时间间隔进入，与Beads一起进入油相中形成油包水结构。如下图所示，Beads上的寡核苷酸链依次为Illumina Nextera Read 1测序引物、12bp Barcode序列（用于区分细胞）、8bp UMI（区分细胞的不同转录本并去除PCR Duplications，降低扩增偏好性）、30 bp poly dT。在随后的文库构建中，相同的细胞扩增出的cDNA带有相同的细胞Barcode，其中来自相同的转录本的cDNA会带有相同的UMI，由此，便可区分出不同细胞扩增出的cDNA。一般而言，每个油包水只会包含一个细胞和一个凝胶珠，但有时候也会出现其他情况，对于这种情况则需要通过在后续分析中识别出来并进行去除。
2.3 cDNA生成与扩增
在油包水结构中，Beads中的polyT捕获mRNA中的polyA。随后进行破油，并进行逆转录反应生成cDNA。随后进行cDNA的扩增反应，纯化后进行质检，质检合格后进行文库构建。
2.4 文库构建
cDNA扩增完成后，利用Tn5酶将cDNA打断成片段，并加入测序引物接头，连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index、P5、P7接头，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库，文库质检合格后再上机测序。
2.5 文库测序
文库质检合格后，就使用Illumina双端测序平台进行测序。如图所示，Illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis,SBS）。
